Este kit se emplea en la detección cualitativa in vitro de los genes ORF1ab y S del SARS-CoV-2 en muestra de garganta, muestra nasofaríngea y esputo. También se puede utilizar para detectar mutaciones L452R, E484Q y P681R en genes S del SARS-CoV-2.
La variante india prevalente del SARS-CoV-2, B.1.617, incluye las mutaciones L452R, E484Q y P681R. Entre ellas, las mutaciones L452R y E484Q se encuentran en el dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína de la espícula (proteína S). Se ha notificado que estas mutaciones pueden aumentar la interacción entre la proteína S y el huésped, lo que puede conducir a un aumento significativo de la infecciosidad y del escape inmunológico. Mientras que la mutación P681R localizada en el sitio de escisión de furina S1/S2, puede tener un gran impacto en la capacidad del virus para unirse a las células huésped. En consecuencia, la proteína S escindida por furina ya no es estable y el dominio de estructura abierta queda expuesto, aumentándose la afinidad de unión de la proteína S y el receptor ACE2 humano. La mutación P681R puede acelerar la escisión de furina S1/S2, lo que conduce a una mayor propagación del virus.
CARACTERÍSTICAS
Este kit adopta la técnica del sistema de amplificación refractario de mutaciones (ARMS) para detectar las mutaciones . Los cebadores del gen ORF1ab y las mutaciones L452R, E484Q y P681R del gen S están diseñados específicamente según el genoma del SARS-CoV-2. Las sondas para ORF1ab, L452R, E484Q y P681R están marcadas, respectivamente, con diferentes colorantes fluorescentes y las mutaciones son detectadas examinando el ∆Ct entre el gen de mutación diana y del ORF1ab.
Este kit contiene un control interno (RNAsa P) para controlar la obtención, el transporte y la extracción de las muestras para evitar un resultado falso negativo.
Tipo de muestras
- Muestras de las vías respiratorias superiores: hisopo de garganta e hisopo nasofaríngeo.
- Muestras de las vías respiratorias inferiores: esputo.
INSTRUCCIONES DE USO
Toma de muestra
- La muestra de hisopo debe obtenerse con un hisopo de plástico con cabeza de fibras de polipropileno. No se permite el uso de hisopo de madera con algodón. La muestra se conserva en medio de transporte de virus tras su obtención.
- La muestra de esputo se obtiene en un recipiente de plástico de 50ml con medio de transporte de virus. Se añade un tampón de digestión (con 1g/l de proteinasa K en PBS) al tubo de muestras en una relación 1:1 (v/v), se agita para mezclar y se espera 5minutos antes de la extracción de ácidos nucleicos.
Preparación del reactivo
Saque el kit, descongélelo a temperatura ambiente, agítelo bien en vórtex, centrifugue a baja velocidad durante 10 segundos y calcule el número de reactivos a preparar (N = el número de muestras + 2 tubos de control). Ambas soluciones de reacción A y B deben probarse para cada muestra. Los reactivos para cada test se enumeran a continuación:
Tabla de reactivos para la reacción A (por test)
|
Reactivo |
Volumen/test |
|
RT-PCR Buffer |
7,5μl |
|
RT-PCR Enzyme Mix |
5μl |
| Reaction Mix A |
7,5μl |
| Volumen total |
20μl |
Tabla de reactivos para la reacción B (por test)
|
Reactivo |
Volumen/test |
|
RT-PCR Buffer |
7,5μl |
| RT-PCR Enzyme Mix |
5μl |
| Reaction Mix A |
7,5μl |
| Volumen total |
20μl |
Vuelva a comprobar la cantidad de reacción (N), incluida la cantidad de muestra (n) que se va a analizar y la cantidad de control negativo y positivo (se acepta la sobredosis). Prepare la mezcla maestra según la tabla anterior y distribúyala en 2 tubos de PCR.
Procesamiento de muestras
Extracción de ácidos nucleicos
Siga las instrucciones del fabricante del kit para la extracción. Los controles positivos y negativos deben estar implicados por completo en el proceso de extracción de ácidos nucleicos.
Adición del eluido de extracción de la muestra
Añada 5 μl de muestras de ácido nucleico, control positivo y control negativo a los tubos de PCR preparados con 20 μl de la reacción A o B respectivamente, de forma que cada tubo contenga un volumen final de 25 μl de mezcla, apriete la tapa del tubo y centrifúguelos instantáneamente a baja velocidad.
Amplificación y detección
Configuración de parámetros de ciclos.
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Paso |
Temperatura | Tiempo | Número de ciclos | |
|
1 |
Transcripción inversa | 50°C | 10min | 1 |
| 2 | Predesnaturalización | 97°C |
1min |
1 |
| 3 | Desnaturalización | 97°C | 5s |
45 |
|
Hibridación, ampliación y detección de fluorescencia |
58°C |
30s |
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Detección de fluorescencia a 58 °C en el paso 3, canales: FAM, VIC y CY5 |
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Valor de corte
- Positivo: Ct ≤40,0 y curva de amplificación con forma de S.
- Negativo: Ct >40,0 o indet.
- Mutación en el sitio
∆Ct de la mutación X de una muestra es igual al valor de Ct de la muestra (Mx) menos el valor de Ct del ORF1ab: ∆Ct(x) = Ct(Mx) –Ct(ORF1ab); ∆Ct puede ser negativo. Los valores de ∆Ct de corte de las mutaciones L452R, E484Q y P681R se determinan mediante el análisis de la curva ROC.
| Tipo de mutación | L452R | E484Q |
P681R |
| Valor de ∆Ct de corte | 10,0 | 4,0 |
10,0 |
Nota: Se puede determinar directamente que la muestra es del tipo salvaje de L452R, E484Q y P681R si solo se observa la curva de amplificación de ORF1ab durante la detección.
Interpretación y notificación de los resultados
Los resultados deben interpretarse cuando el sistema, el control positivo y el control negativo funcionan correctamente. Tubo de reacción A: el canal FAM se utiliza para la mutación L452R, el canal VIC para la mutación P681R, el canal CY5 para RNasa P; tubo de reacción B: el canal FAM se utiliza para el gen ORF1ab y el canal VIC para la mutación E484Q.
| Tubo de reacción | Canal | Sitio | Valor de Ct y ∆Ct de referencia | Interpretación de los resultados |
| A | FAM | L452R | Ct: 40,0 | Si el valor de Ct ≤40,0 y ∆Ct <10,0, se considera que la muestra contiene la mutación L452R. De lo contrario, se considera que la muestra es de tipo salvaje. |
| ∆Ct: 10,0 | ||||
| VIC | P681R | Ct: 40,0 | Si el valor de Ct ≤40,0 y ∆Ct <10,0, se considera que la muestra contiene la mutación P681R. De lo contrario, se considera que la muestra es de tipo salvaje. | |
| ∆Ct: 10,0 | ||||
| CY5 | RNasa P | Ct: 37,0 | El valor de Ct del canal CY5 (control interno) debe ser ≤37,0; de lo contrario, es necesario obtener nuevas muestras. Cuando el ORF1ab de una muestra es positivo (valor de Ct ≤40,0) pero el valor de Ct del control interno >37,0 o no se detecta, el resultado sigue siendo válido. | |
| B | FAM | ORF1ab | Ct: 40,0 | Si el valor de Ct ≤40,0, la muestra puede considerarse positiva para SARS-CoV-2. De lo contrario, la muestra puede considerarse negativa para SARS-CoV-2. |
| VIC | E484Q | Ct: 40,0 | Si el valor de Ct ≤40,0 y ∆Ct <4,0, se considera que la muestra contiene la mutación E484Q. De lo contrario, se considera que la muestra es de tipo salvaje. | |
| ∆Ct: 4,0 |
Las variantes se identifican de acuerdo con la interpretación de los resultados anteriores de diferentes sitios.
|
Tipo |
L452R | E484Q | P681R |
|
B.1.617.1/B.1.617.3 |
Mutación | Mutación | Mutación |
| B.1.617.2 | Mutación | Tipo salvaje |
Mutación |
| Variante que no es B.1.617 | Tipo salvaje | Tipo salvaje |
Tipo salvaje |
Límite de detección (LD): 500 copias/ml.
CONTENIDO DEL KIT
|
Componente |
Cantidad | Volumen/25 T | Volumen/50 T |
Ingredientes |
| RT-PCR Buffer | 1 | 375μl | 750μl |
Tris (hidroximetil) aminometano, cloruro de potasio, cloruro de magnesio y dNTP |
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RT-PCR Enzyme Mix |
1 | 250μl | 500μl | Transcriptasa inversa, inhibidor de la RNasa y polimerasa Taq ADN |
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Reaction Mix A |
1 | 188μl | 375μl | Cebadores y sondas de L452R, P681R y RNasa P |
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Reaction Mix B |
1 | 188μl | 375μl |
Cebadores y sondas de E484Q y ORF1ab |
| Positive control | 1 | 500μl | 500μl |
Partículas similares a virus de ORF1ab, S y RNasa P |
| Negative control | 1 | 500μl | 500μl |
Partículas similares a virus de RNasa P |
