En Ecuador, el cultivo de camarones o camaronicultura es una de las principales actividades económicas, exportando aproximadamente 17,4% del total de exportaciones para el 2019, lo que equivale a 645.000 toneladas métricas. Así, la camaronicultura ha tenido un desarrollo sostenido. Desde el 2010 se encuentra en constante auge hasta la actualidad.
Para lograr mantenerse en crecimiento se ha logrado importantes avances en cuanto a involucrar a la biotecnología dentro de los procesos de su cultivo, desde manipulación del ciclo biológico del camarón, modificaciones genéticas y selección de líneas parentales de mejor rendimiento, mejora requerimientos nutricionales de las distintas especies en cultivo y se considera que, implementar herramientas moleculares para el control de enfermedades causadas por diversos agentes patógenos ha permitido a la camaronicultura enfrentar retos en los cultivos y prevenir daños significativos en el nivel productivo.
La implementación de métodos de nivel molecular permite llevar un buen control de enfermedades en los cultivos de camarón reduciendo las probabilidades de un daño significativo causado por agentes infecciosos. Actualmente, la implementación de un laboratorio de biología molecular es una inversión necesaria para nuestras camaroneras. Detallamos como podemos implementar un Laboratorio de Biología Molecular para Diagnóstico de Enfermedades en Camarones.
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Diseño de un Laboratorio de Biología Molecular
En los laboratorios de biología molecular podemos implementar distintas áreas, desde preparación de reactivo, extracción de ADN, PCR, electroforesis, cuarto oscuro y esterilización, con el objetivo de mantener un control de enfermedades sobre nuestras piscinas de cultivo.
Para la organización óptima del laboratorio, se debe considerar ciertos puntos:
- Delimitación de las actividades por área del laboratorio: deben tomarse las precauciones necesarias para las actividades en grupo en una única sala o para delimitar claramente el espacio físico de ciertas actividades específicas, aplicándose las medidas necesarias para evitar la contaminación cruzada de las muestras.
- El área de biología molecular tiene que estar situada en un espacio separado, con al menos dos salas: Un área donde se realizarán los procesos de extracción de muestra (preparación de mezclas de reactivos y amplificación del ADN); los sistemas de iluminación ultravioleta para las fotografías de gel de ADN, requieren una sala oscura y equipos adecuados de protección ocular.
Extractores automatizados y Termocicladores
Parte importante del procesamiento tras la toma de muestras es estandarizar procesos de extracción y purificación de ácidos nucleicos.
Según el tipo de muestra, podemos utilizar kits comerciales como Kit de extracción de ADN genómico tisular Biospin y Kit de extracción de ácidos nucleicos virales (Columna de centrifugado a base de sílice). Por otro lado, si nuestro laboratorio está enfocado a un flujo masivo de muestras o un nivel de procesamiento alto, es recomendable asistirse con equipo automatizados, tales como el Sistema de Extracción de Ácido Nucleico SSNP-2000B y Sistema de Extracción de Ácido Nucleico SMPE-960, equipos capaces de brindar un alto rendimiento (32 muestras y 96 muestras a la vez, respectivamente), al extraer los ácidos nucleicos virales de alta calidad (ADN y ARN) a través de perlas magnéticas y un sistema tampón.
Tras la obtención de ácidos nucleicos de interés, otro de los procesos importantes dentro del proyecto de diagnóstico de enfermedades es la amplificación de ácidos nucleicos llevada a cabo por la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa, la cual se realiza en equipos denominados Termocicladores.
Existen termocicladores de punto final como Mastercycler Nexus Gradient que tienen la cualidad de brindar gradientes de temperaturas ideales para utilizar distintos tipos de reactivos PCR y permite obtener resultados significativos y reproducibles. Cuando utilizamos este tipo de equipos es importante con un proceso denominado electroforesis, que es donde revelaremos la presencia o ausencia de los agentes patógenos.
Como una alternativa para evitar pasos posteriores tras la PCR, existen los termocicladores en tiempo real, que nos permiten observar los resultados de manera casi inmediata mientras el proceso sigue en curso. Este proceso es posible en equipos más especializados como Line-Gene K Plus y o Linegene9600 Plus que cuentan con escaneo de bloque completo y escaneo a doble color de 96 pocillos con un sistema de detección de fluorescencia de 6 canales.
Electroforesis
La electroforesis es una técnica nos permite diferenciar y separar el ADN, el ARN, o moléculas o proteínas en base a su tamaño y carga eléctrica. Se utiliza una corriente eléctrica para mover las moléculas y que se separen a través de un gel. Esta técnica nos es útil para detección de proteínas, mutaciones genéticas y detección de material genético de agentes patógenos por lo que las pruebas de diagnóstico en cultivos de camarones para muchos casos se realizan mediante electroforesis.
Para poder aplicar la carga se utiliza Sistema Horizontal Electroforesis y Sistema Vertical de Electroforesis, equipos que permiten el cribado de alto rendimiento de muestras, de alta resolución, y está diseñada para soportar los rigores del uso diario de grandes cantidades de muestras , incluidos los productos de la PCR de placas de 96 pocillos , el análisis de RFLP, proyecciones de plásmido o análisis de proteínas.
Equipos complementarios
Para las dos áreas principales dentro de un laboratorio de biología molecular es importante contar con equipos complementarios que se ocupan durante todo el proceso de diagnóstico.
Para el área de extracción de ácidos nucleicos se debe disponer de una cabina de bioseguridad clase II tipo A2, la cual protege tanto al usuario como a las muestras de algún agente contaminante; mientras que para el área de preparación y mezclas de reactivos, se debe priorizar la protección de los reactivos, por lo que una cabina de flujo laminar sería nuestra mejor opción.
En ambas áreas además utilizaremos equipos complementarios como centrífuga multipropósitos, centrifugas para microtubos y pipetas de volumen variables, generalmente de tres volúmenes nominales (10, 200, 1000), Centrífuga Minispin y Vórtex; para la implementación de estos equipos LABOMERSA S.A. ofrece opciones en las marcas EPPENDORF, BRAND y DLAB.
Además, debemos disponer de insumos variables como puntas con Filtro, pocillos o placas para PCR y microtubos.
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Reactivos
Alrededor del mundo, varios virus, bacterias y otros patógenos han sido como identificados como agentes infecciosos en cultivos de camarón, afectando significativamente la producción; sin embargo, existen patógenos más perjudiciales, tales como:
- Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV).
- Virus de la Necrosis Infecciosa Hematopoyética e Hipodérmica (IHHNV).
- Virus Hepatopancreático (HPV).
- Virus del Síndrome de la Nucleosis Poliédrica de P. Vannamei (PvSNPV, o virus tipo BP).
- Virus Iridiscente de Hemocitos del Camarón (VID1 o SHIV).
- Vibriosis.
- Enterocitozoon Hepatopenaei (EHP) y Síndrome de Mortalidad Temprana (EMS).
- Virus del Síndrome de la Nucleosis Poliédrica de P. Monodon (PmSNPV o virus tipo MBV).
- Virus de la Necrosis de la Glándula Digestiva (BMN).
- Virus del Síndrome de Taura (TSV).
- Virus de la Cabeza Amarilla (YHV).
Muchos de estos agentes se pueden detectar por técnicas como PCR convencional, PCR LAMP, RT PCR junto a electroforesis o de una manera más rápida mediante PCR en tiempo real. Por ello, LABOMERSA S.A. para su detección temprana, recomienda los kits de PCR en tiempo real para detección de enfermedades de camarón, ya que están diseñados con sondas específicas dirigidas a los patógenos de interés en la camaronicultura.
LABOMERSA S.A. ofrece asesoría paso a paso para la implementación de su laboratorio de biología molecular, cumpliendo estándares solicitados por los organismos reguladores del país.
