La cromatografía es una técnica que nos permite principalmente separar, identificar y cuantificar los componentes de una muestra mediante su interacción en dos fases: una fase estacionaria de gran área superficial, y una fase móvil.

¿Qué es la cromatografía líquida HPLC?

La cromatografía HPLC es un tipo particular de cromatografía líquida, las siglas HPLC son el acrónimo en inglés de High Performance Liquid Chromatography, que significa Cromatografía Líquida de alta resolución o alta eficiencia. La cromatografía HPLC se utiliza generalmente para la identificación de pequeñas moléculas, sin embargo, es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales lábiles, materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso molecular.

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Esta técnica permite separar físicamente y cuantitativamente los distintos componentes de una solución por la absorción selectiva de los constituyentes de una mezcla, cuando los componentes pasan a través del sistema a diferentes velocidades, estos se separan en determinados tiempos. Cada componente tiene un tiempo característico de paso a través del sistema cromatográfico, llamado tiempo de retención, la separación cromatográfica se logra cuando el tiempo de retención de la sustancia de interés o analito, difiere del resto de componentes de la muestra.

¿Qué equipos y materiales son necesarios para trabajar en HPLC?

Debemos tomar en consideración que previo al análisis por HPLC es necesario un proceso de preparación de la muestra; dependiendo del tipo a muestra a analizar se pueden requerir diferentes equipos e instrumentos, sin embargo, los equipos que generalmente se utilizan en esta etapa son los siguientes:

Balanza analítica

Plato de agitación y calentamiento

Baños de agua o baño maría

Baño ultrasónico digital

Molino Multiuso

Centrífugas

Vórtex

Insumos

• Balones aforados
• Matraces Erlenmeyer
• Embudos y Papel filtro
• Vasos de precipitado
• Filtros para jeringa
• Viales para HPLC
• Botellas para solventes

Una vez superada la etapa de preparación se procede con la etapa denominada instrumental. Al ser un tipo de cromatografía líquida, la fase móvil será un líquido mientras que la fase estacionaria será un sólido, concretamente una columna cromatográfica. El equipo para HPLC está conformado por los siguientes componentes básicos:

Un depósito para la fase móvil

Los solventes que conforman la fase móvil por lo general son contenidos en botellas de vidrio, los equipos HPLC cuentan con un espacio o compartimento para colocarlos.

Un Sistema de Bombeo

Otorgará la presión necesaria para transportar la fase móvil a través del sistema cromatográfico, funcionan con sistemas de pistones y según su capacidad de transportar uno o más solventes pueden ser bombas primarias, binarias, terciarias o cuaternarias. Los sistemas más utilizados contienen bombas cuaternarias.

Un sistema de inyección de Muestras

Consiste en un módulo que contiene esencialmente una aguja y una bandeja porta muestras, la aguja se encarga de tomar la cantidad de muestra requerida para el análisis. Debido a que los sistemas actuales cuentan con inyectores automáticos la reproducibilidad de los ensayos es muy precisa.

Un horno para columnas

Es un compartimento especial para colocar la columna cromatográfica, esta columna es el corazón del sistema cromatográfico pues contiene la fase estacionaria y es aquí donde se produce la retención y separación de los diferentes compuestos.

En el horno en cambio, se puede programar diferentes temperaturas para colocar y acondicionar la columna.

 Un detector

Se trata de un sistema óptico, generalmente un arreglo de diodos con detección UV-Vis, que muestra la señal óptica emitida por los compuestos separados en la muestra, por lo tanto, estos compuestos deben presentar cierta actividad óptica para que puedan ser detectados por el instrumento, por esta razón existen distintos tipos de detectores según el tipo de muestra a analizar.

Un registrador

Una vez que la señal óptica es detectada por el instrumento, esta es enviada a un registrador de la señal, es decir, un software informático que traduce la señal en una imagen, adicionalmente este software permitirá ingresar todas las variables y de ese modo realizar los cálculos y cuantificar los compuestos analizados.

Labomersa cuenta con un amplio portafolio de productos para cumplir con sus requerimientos en cuanto a técnicas cromatográficas y de HPLC. Además, contamos con personal altamente capacitado para asesorarlo en la elección del instrumental correcto para sus análisis.

El término cromatografía proviene de la palabra griega chroma que significa color y graphein que significa escribir, se refiere a una escritura en color o a través del color. Los primeros ensayos de esta técnica consistían en la extracción de pigmentos de plantas con la ayuda de un solvente orgánico. El primer uso registrado de la cromatografía en columna se le otorga al científico ruso Mikhail Tsvet que trituró carbonato de calcio en un tubo y posteriormente agregó hojas de una planta verde homogeneizadas, seguido de un solvente orgánico. Tsvet observó bandas de colores separadas a medida que el solvente pasaba a través del tubo.

¿Qué es la cromatografía?

Actualmente cromatografía es el nombre que se le da a un grupo de técnicas utilizadas en la determinación de la identidad de sustancias, en la separación de componentes de las mezclas y en la purificación de compuestos. Esta técnica es muy efectiva y por lo tanto se utiliza tanto a nivel de investigación como a nivel industrial.

Aunque actualmente existen variaciones de la técnica dependiendo de las necesidades o el tipo de sustancias a investigar, todos los sistemas contienen una fase estacionaria y una fase móvil; la fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido que se queda fijo en la misma posición, mientras que la fase móvil puede ser un líquido o un gas que corre a través de una superficie y de la fase estacionaria.

Los componentes en una muestra a analizar se irán distribuyendo entre estas dos fases, a medida que la fase móvil atraviesa la fase estacionaria en un proceso denominado elución, la separación de los distintos componentes de la muestra se da como resultado de repetidos procesos de sorción-desorción de estos componentes debido a su afinidad química por una u otra fase, finalmente, la separación de estos componentes se puede visualizar mediante una gráfica denominada cromatograma.

¿Qué tipos de Cromatografía existe?

Aunque los principios fundamentales son los mismos, por fines prácticos se acostumbra clasificar los métodos cromatográficos según el estado físico de la fase móvil, según esta clasificación tenemos la cromatografía líquida, cromatografía de gases y cromatografía de fluidos supercríticos.

En la cromatografía líquida, la fase móvil es un solvente o mezcla de solventes y la fase estacionaria un sólido que interactúa con las sustancias que se desea separar, (cromatografía líquido-sólido) o bien, un líquido inmiscible con la fase móvil depositado en la superficie de un sólido (cromatografía líquido-líquido).

Existen diferentes arreglos para este tipo de cromatografía, puede hacerse en columna, en papel o en capa fina y en HPLC. En el próximo blog se abordará esta técnica con más detalle.

En la cromatografía de gases la fase móvil es un gas inerte (helio o nitrógeno) y la fase estacionaria es un sólido (cromatografía gas-sólido) o un líquido “sostenido” por un sólido inerte (cromatografía gas-líquido). Este tipo de cromatografía siempre es en columna, ya que es la única manera de que la fase móvil gaseosa se mantenga fluyendo, confinada dentro del sistema. La columna puede estar rellena con la fase estacionaria, en forma semejante a la cromatografía líquida, o bien la fase estacionaria puede depositarse sobre las paredes de un tubo muy delgado (0.25mm de diámetro) y largo (hasta 100m). Este tipo de columnas se conocen como columnas capilares y proporcionan la mayor capacidad de separación.

Finalmente, la cromatografía con fluido supercrítico (SFC) es una técnica de separación en la que la fase móvil es un fluido por encima de sus temperatura y presión críticas. Se utiliza para el análisis y purificación de moléculas de bajo a moderado peso molecular. Los principios son similares a los de HPLC sin embargo en SFC se utiliza típicamente CO2 como fase móvil.

Continúa leyendo: ¿Qué equipos necesita mi laboratorio para aplicar técnicas por Cromatografía Líquida HPLC?

¿Para qué sirve la cromatografía?

Las técnicas cromatográficas son muy útiles para la separación de compuestos de distinta naturaleza contenidos en una muestra, además nos permite identificar estas sustancias, cuantificarlas y clasificarlas de acuerdo a su pureza de una manera muy precisa, algo que es muy valorado en un laboratorio de ensayos, puesto que estos necesitan cerciorarse de que las metodologías que utilizan en sus análisis son los suficientemente confiables para garantizar la validez de sus resultados, hemos de decir que, en ese sentido, las técnicas cromatográficas, en especial la cromatografía de Gases y HPLC son las idóneas para este propósito debido a su alto nivel de sensibilidad y exactitud de los resultados.

Para más información acerca de qué equipos son necesarios en análisis por cromatografía de gases y HPLC, contáctanos. Contamos con un equipo de expertos que podrán asistirte según tus requerimientos. Esta publicación continúa en nuestros blogs informativos de Farmacéutica.